Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind Nanometer große Partikel (30nm bis 1000nm) die von Zellen abgegeben werden können und selbst nicht mehr vermehrungsfähig sind. Diese Partikel haben als großes Charakteristikum eine Lipid-Doppelmembran und dienen als Transporter für diverse Biomoleküle. Diese Biomoleküle dienen der Kommunikation, weshalb sie in der medizinischen Forschung eine immer wichtigere Rolle spielen. Sie sollen in Zukunft nicht nur als Biomarker für unterschiedlichste Krankheiten verwendet werden, sondern auch für die Therapie von Erkrankungen eingesetzt werden, indem sie Wirkstoffe verpacken und zu spezifische Zielzellen transportieren.
Die CF ABPCI hat sich auf Protokolle für die Isolierung und Charakterisierung von extrazellulären Vesikeln aus Zellkulturüberständen spezialisiert.
Isolierung von EVs
EVs können in so gut wie allen Körperflüssigkeiten nachgewiesen werden. Die CF ABPCI hat sich auf die Isolierung von EVs aus Blutplasma und auch Zellkulturüberständen spezialisiert. Je nach Anwendungsgebiet kann zwischen Ultrazentrifugation (UZ) und Size Exclusion Chromatographie (SEC) gewählt werden.
Von der Internationalen Society für EVs wurde 2018 eine Empfehlung herausgegeben, wie EVs isoliert und charakterisiert werden sollten um reproduzierbare und verlässliche Daten garantieren zu können. Zur Etablierung der Protokolle und bei der Planung von Versuchen wird von der CF ABPCI stets darauf geachtet diese Empfehlungen in die Arbeit einfließen zu lassen. Link zur Empfehlung
Ultrazentrifugation (UZ)
Size Exclusion Chromatography (SEC)
SEC erfreut sich einer immer größeren Beliebtheit in der Community, da diese Methode neben einer großen Ausbeute auch sehr native EVs verspricht. Außerdem läuft die Isolierung relativ rasch ab und könnte in weiteren Schritten auch automatisiert werden.
Zurzeit werden EVs aus PFP (=platelete free plasma) mit Sepharose SEC-Säulen isoliert, die zuvor mit PEG (=Polyethylenglycol) gefällt werden können.
Flow Assisted Cell Sorting (FACS)
Die FACS ist neben der Elektronenmikroskopie die vermutlich wichtigste Methode für die Erforschung von EVs. Großer Vorteil ist hier, dass einzelne EVs der Reihe nach auf gleich mehrere Marker untersucht werden können. Aufgrund der geringen Größe der Partikel sind jedoch hier ganz spezielle Methoden und Einstellungen zu verwenden, die sich stark von „normalen“ FACS Messungen unterscheiden.
Nano Tracking Analysis (NTA)
NTA wird verwendet um die Größenverteilung (30nm bis 1000nm) und Partikelkonzentration von EVs in Proben abschätzen zu können. Dabei werden die Partikel von einem Laser angeregt. Deren Brownsche Teilchenbewegung wird dann von einem Mikroskop gefilmt. Dieses Bildmaterial wird von einer Software ausgewertet und die Größe sowie die Konzentration der gemessenen Partikel berechnet.
Western Blot (WB)
WB wird vor allem für die Charakterisierung der isolierten EVs verwendet. Als Reinheitskriterium gelten Tetraspanin-Marker (CD9, CD63 und CD81), die es nachzuweisen gilt. Je nach verwendetem Biomaterial gibt es negative Marker, die idealerweise nicht oder kaum in den Proben nachgewiesen werden können. Im Falle von Blut sind das Marker (z.B. Apolipoprotein A1) für Lipoproteinpartikel, die EV Proben oft verunreinigen.
